Cultura de Tecidos Vegetais

 

PEREIRA, C. D.

MELO, B.

 

SUMÁRIO

 

1- Histórico;

2- Estrutura de um laboratório de cultura de tecidos;

3- Equipamentos;

4- Meios nutritivos;

5- Componentes de meios nutritivos;

6- Preparação dos meios de cultura;

7- Esterilização;

8- Tipos de cultivos e aplicações da cultura de tecidos;

8.1- micropropagação;

8.2- Recuperação de plantas isentas de vírus (limpeza clonal);

8.3- Microenxertia;

8.4- Conservação in vitro de recursos genéticos de plantas – conservação de germoplasma;

8.5- Suspensão celular;

8.6- Polinização e fertilização in vitro;

8.7- Cultura de embriões;

8.8- Cultura de ovários;

8.9- Cultura de protoplastos;

8.10- Obtenção de mutantes in vitro;

8.11- Embriogênese somática;

8.12- Produção de haplóides e duplos haplóides;

9- Cultura de tecidos vegetais x plantas transgênicas;

10- Bibliografia consultada.

11- Links na área

 

HISTÓRICO

A biotecnologia amplamente definida, inclui qualquer técnica que usa organismo vivo ou parte dele para fazer ou modificar produtos, melhorar plantas e animais, ou desenvolver microorganismos para uso específico. Neste contexto as técnicas de cultura de células, tecidos e órgãos vegetais compõem um importante grupo da biotecnologia em plantas.

Os primeiros trabalhos com cultura de tecidos, foram iniciados em 1902, com o pai da cultura de tecidos Haberlandt. Estudando a regeneração de plantas originadas de uma única célula, não obteve sucesso em seus experimentos, possivelmente, em virtude da falta de “fitormônios”( compostos até então desconhecidos) no meio nutritivo, bem como em decorrência da utilização de espécies inadequadas, e da baixa densidade de inóculo e explantes de tecidos maduros. No entanto seu trabalho contribui de forma decisiva para o desenvolvimento de pesquisas futuras nesta área.

Hannig (1904) foi o primeiro a cultivar in vitro embriões imaturos de crucíferas (Raphanus sativus, R. landra, R. caudatus e Colchlearia danica). Ele observou a necessidade de suplementação do meio mineral com sacarose para germinação dos embriões, bem como mostrou o efeito de diferentes fontes de nitrogênio sobre a sua morfologia. Aiblach (1925) foi o primeiro a visualizar a aplicação da cultura de embriões no melhoramento genético, recuperando plantas híbridas de cruzamentos incompatíveis entre Linum austriacum x L. perene.

White (1934) recebeu o mérito do estabelecimento do primeiro trabalho de cultura de tecidos, com a elaboração de um meio (líquido) capaz de manter o crescimento de ápices radiculares de tomateiro (Lycopersicon esculentum) por um período ilimitado. Com esse trabalho mostrou a importância de tiamina para o crescimento de raízes in vitrom. Também elaborou a “mistura orgânica” que leva o seu nome, utilizada até hoje nas formulações de meios nutritivos.

Outra importante descoberta foi a identificação do primeiro fitormônio, a auxina, ácido indolacético (Kogh et al., 1934). Isso possibilitou o estabelecimento e manutenção indefinida de cultura de calo de cenoura. O interesse do grupo, liderado por Skoog no controle químico da organogênese, concretizou-se com a descoberta da cinetina (primeira citocinina) por Miller et al. (1955; 1956), dando uma grande contribuição à área de cultura de tecidos e ao estudo da fisiologia do crescimento e desenvolvimento de plantas.

No Brasil, os trabalhos pioneiros sobre cultura de tecidos surgiram com Dr. Agesilau Bitancourt, do Instituto Biológico de São Paulo, na década de 50. Uma equipe de cultura de tecidos se estabeleceu na ESALQ, Piracicaba, em 1971, sob a liderança do Dr. Willian Sharp e da Dra. Linda Caldas, onde iniciaram vários trabalhos na área.

 

ESTRUTURA DE UM LABORATÓRIO DE CULTURA DE TECIDOS

Sala de limpeza

É o local destinado ao descarte de meios de cultura utilizados e outros resíduos, lavagem de vidraria, autocalvagem de água, de meios de cultura e de utensílios diversos. Por estes procedimentos em si, esta sala constitui um local onde as condições de assepsia deixam a desejar.

Sala de preparo

Local destinado ao preparo de meios de cultura e de soluções diversas, bem como de material vegetal destinado à introdução in vitro.

Sala de transferência

É onde se manipula assepticamente o material vegetal, sendo um local exclusivo para a capela de fluxo laminar e as estantes para estocagem temporária dos meios de cultura já autoclavados, além de outros materiais esterilizados destinados ao uso imediato. A circulação de pessoal nesta sala deve ser restrita.

Sala de cultura

É a área onde as culturas serão mantidas até o momento de serem retiradas dos frascos. Deve ser dotada de estantes iluminadas, com prateleiras de 50cm de largura e distanciadas entre si de 40-45cm. A temperatura desta sala deve ser mantida em torno de 27 oC, mediante o emprego de aparelhos de ar condicionado. O fotoperíodo é mantido, normalmente, em 16h e a intensidade luminosa variando de 50-60mmol m-2. s-1.

EQUIPAMENTOS

Autoclave

Utilizada para esterilização de meio de cultura, vidraria, água e outros materiais.

Destilador e Deionizador

São aparelhos utilizados para eliminar sais minerais da água.

Aparelho de banho-maria

Útil par aquecimento moderado de soluções, meios d cultura e fusão de ágar, quando necessário.

Aquecedor de água

Imprescindível para a lavagem eficiente de frascos contendo meio de cultura semi-sólido, dentre outras aplicações.

Lavador de pipetas

Equipamento de baixo custo e essencial para simplificar o trabalho de lavar pipetas.

Refrigerador (geladeira)

Manutenção de soluções estoque e reagentes diversos.

Freezer

Utilizado para estocagem de reagentes que exigem temperatura abaixo de 0oC.

Balança

Necessária para a pesagem de macronutrientes e outros reagentes usados em maior quantidade.

Balança de precisão ou analítica

É imprescindível para a pesagem de quantidade mínimas de alguns reagentes como os reguladores de crescimento e alguns micronutrientes.

Medidor de pH

Necessário para a determinação e ajuste do pH de meios de cultura, o qual influencia categoricamente no sucesso do cultivo.

Agitador magnético

Auxilia na dissolução de reagentes e determinação de pH.

Dessecador

Utilizado na manutenção de frascos de certos reagentes muito higroscópios, em pó após abertos.

Capela de fluxo laminar

Imprescindível para os trabalhos de manipulação asséptica. Este equipamento força a passagem de ar por meio de um filtro bacteriológico, de modo que seja criado um ambiente estéril com pressão positiva, que evita a entrada de ar externo contaminado.

Microscópio estereoscópico

Utilizado na identificação e manipulação de pequenas estruturas vegetais (meristemas, pólen etc) ou de estruturas desenvolvidas in vitro.

 

MEIOS NUTRITIVOS

Os meios nutritivos utilizados para a cultura de células, tecidos e órgãos de plantas fornecem as substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão de desenvolvimento in vitro. As mesmas vias bioquímicas e metabólicas básicas que funcionam nas plantas são conservadas nas células cultivadas, embora alguns processos, como fotossíntese, possam ser inativados pelas condições de cultivo e pelo estado de diferenciação das células. Por isso, os meios nutritivos se baseiam nas exigências das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificações para atender às necessidades específicas in vitro. Complementando as substâncias biossintetizadas pelas células, vários compostos orgânicos são adicionados ao meio para suprirem as necessidades metabólicos, energéticos e estruturais das células.

Alguns dos primeiros meios apresentavam, entre os micronutrientes, metais exóticos como níquel, titânio e berílio, além dos mais comuns (ferro, manganês, zinco, cobre e boro). A lista dos minerais incluídos na maioria dos meios utilizados hoje foi definida por White (1943b; 1945). O meio de White continha, ainda, vitaminas e sacarose como suplementos orgânicos. Dos hormônios vegetais, ou reguladores de crescimento, apenas a auxina ácido 3-indolacético era conhecida nas décadas de trinta e quarenta.

Na tabela 1 são mostradas as concentrações dos diversos componentes de um dos principais meios nutritivos, Murashige e Skoog, utilizado na técnica de cultura de tecidos vegetais.

 

Tabela 1- Composição do meio de cultura de Murashige & Skoog (1962).

 

CONSTITUINTES

QUANTIDADE em mg/L

INORGÂNICOS

 NH4NO3

1650

KNO3

1900

CaCl2 2 H2O

440

MgSO4 7 H2O

370

KH2PO4

170

KI

0,83

H3BO3

6,2

MnSO4 4 H2O

22,3

ZnSO4 7 H2O

8,6

Na2MoO4 2 H2O

0,25

CuSO4 5 H2O

0,025

CoCl2 6 H2O

0,025

FeSO4 7 H2O

27,8

Na2 EDTA 2 H2O

37,3

ORGÂNICOS

Inositol

100

Tiamina Hl

0,1

Ácido Nicotínico

0,5

Piridoxina HCl

0,5

Glicina

2,0

Sacarose

30000

Ágar

0,8%

 

COMPONENTES DE MEIOS NUTRITIVOS

 

No desenvolvimento dos meios nutritivos para a cultura de tecidos de plantas, houve desde o início, uma procura de meios definidos de composição conhecida e controlada. Assim, torna-se possível a reprodução dos resultados em qualquer época ou lugar. Para evitar a contaminação dos meios por impurezas minerais, todos os sais utilizados na sua preparação devem ser de qualidade analítica (‘p.a’.).

 

Água

A água é o componente de maior quantidade no meio. É uma fonte potencial de impurezas que podem afetar o crescimento de tecidos in vitro. A água destilada e deionizada, ou bi-destilada, normalmente, é suficiente pura para uso nos meios. No entanto, dependendo da fonte da água de laboratório (poço artesiano, por exemplo), podem ser encontrados contaminantes orgânicos voláteis, que permanecem após a destilação e inibem o crescimento das culturas.

 

Macronutrientes

Os elementos exigidos em maiores quantidades para o crescimento de plantas inteiras são incluídos nos meios nutritivos na forma de sais inorgânicos, são eles o nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio e enxofre.

 

Micronutrientes

Os micronutrientes incluem todos aqueles elementos minerais aceitos atualmente como essenciais para plantas clorofiladas (manganês, zinco, boro, cobre, cloro, Ferro e molibdênio), além do cobalto e iodo.

 

Carboidratos

As células, tecidos e plântulas cultivadas in vitro não encontram condições adequadas de iluminação e concentração de CO2 e, às vezes, não apresentam teores de clorofila suficiente para realizar fotossíntese que sustenta o crescimento. Portanto, a sacarose é o carboidrato mais utilizado nos meios nutritivos, sendo que esse açúcar suporta as mais altas taxas de crescimento na maioria das espécies. A concentração de sacarose também é um fator importante para obter crescimento ótimo, dependendo do explante. Culturas de embriões nos estágios iniciais de desenvolvimento necessitam de concentrações elevadas de sacarose (12-18%), e altas concentrações também estimulam a formação de embriões em cultura de anteras de fumo (Sharp et al., 1971). A concentração de sacarose mais usada é 3%. Outros compostos orgânicos, além de carboidratos, foram testados como fonte de carbono, normalmente com pouco sucesso.

Vitaminas

Os primeiros estudos com cultura de raízes definiram a mistura básica de vitaminas utilizadas até hoje. Essa mistura consiste de tiamina (vitamina B1), ácido nicotínico (niacina) e piridoxina (vitamina B6), a qual normalmente se adiciona o aminoácido glicina.

Mio-Inositol

O mio-inositol é um componente do meio MS e da maioria dos outros meios em uso atualmente. A concentração mais usada de mio-inositol nos meios é de 100 mg. l-1.

 

Reguladores de Crescimento ou Hormônios

A composição e concentração de hormônios no meio são fatores determinantes no crescimento e no padrão de desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultura de tecidos. As auxinas e as citocininas são as classes de reguladores de crescimento mais utilizadas na cultura de tecidos. A formação de raiz, parte aérea e calo em cultura de tecidos é regulada pela disponibilidade e interação dessas duas classes de reguladores de crescimento.

Existem várias substâncias que pertencem a cada uma dessas classes de reguladores e que são usadas, de acordo com o objetivo do estudo, nos meios de cultura. As várias auxinas (AIA - ácido 3-indolacético, AIB - ácido indolbutírico e 2,4-D ácido 2,4-diclorofenoxiacético, entre outras) dão respostas diferentes in vitro. AIA é considerada uma auxina instável, que se degrada facilmente pela luz ou pela atividade microbiana que a transforma em triptofano.

Também existem diferenças entre as citocininas, sendo que o BAP – 6-benzilaminopurina induz a formação de grandes números de brotos e alta taxa de multiplicação em muitos sistemas de micropropagação. Poucas culturas in vitro mostram respostas às giberelinas.

 

Ágar e Semelhantes

Os meios nutritivos podem ser líquidos ou sólidos, sendo que a cultura em meio líquido normalmente exige algum tipo de suporte ou agitação para fornecer o oxigênio necessário para a respiração do explante. Os meios líquidos possuem a vantagem de preparo mais rápido (e mais barato) do que os sólidos.

Os meios sólidos ou semi-sólidos, tradicionalmente, são solidificados com ágar (polissacarídeo extraído de algas marinhas) o qual é dissolvido em água fervente sendo responsável pela consistência do meio que depende de sua concentração.

 

pH

O pH dos meios nutritivos em culturas de células vegetais é normalmente ajustado com HCl ou NaOH, depois de adicionar todo os componentes, para um valor ligeiramente ácido (entre 5 e 6).

 

PREPARAÇÃO DOS MEIOS

Em diferentes laboratórios, procedimentos diversos são utilizados para preparar os meios nutritivos. Normalmente, mantêm-se soluções-estoque dos sais minerais na geladeira em concetrações mais elevadas, a partir das quais, a preparação do meio é efetuada.

Soluções-estoque das vitaminas podem ser mantidas na geladeira ou no congelador; a sacarose e o mio-inositol, que são utilizados em quantidades elevadas, são pesados sempre que se prepara um meio nutritivo.

 

ESTERILIZAÇÃO

Os meios são esterilizados após serem distribuídos nos frascos ou vasilhames de cultura, por autoclavagem a 121oC (1 kg.cm-2) por 15 – 20 minutos. Os explantes (tecido, orgão ou qualquer parte da planta a ser propagada) também são submetidos a desinfecção. Para isto existem muitas drogas, mas é quase generalizado o emprego de etanol (70%) por 1-2 minutos. Os explantes são imersos nesta solução e mantidos sob constante agitação. Em seguida, deve ser enxaguados com água destilada e imersos em solução de hipoclorito de sódio (2%) durante 15-20 minutos sob agitação e enxaguados com água autoclavada, sendo este passo, feito em câmara de fluxo laminar, evitando a recontaminação do material.

 

TIPOS DE CULTIVOS E APLICAÇÕES DA CULTURA DE TECIDOS

1- MICROPROPAGAÇÃO

Uma das muitas aplicações da micropropagação é a propagação maciça de plantas superiores. Muitas vezes a propagação convencional é um processo lento durante o qual doenças e problemas com patógenos podem diminuir a produção. A micropropagação oferece o potencial para produzir milhares, ou às vezes, bilhões de plantas, em relativo curto espaço de tempo.

Multiplicação por meio de brotos apicais e axilares: ambos, os brotos apicais e axilares contêm meristemas quiescentes ou ativos, dependendo do estado fisiológico da planta. Estes brotos apicais cultivados em meio de cultura, sem reguladores de crescimentos, desenvolvem-se tipicamente em brotos semelhantes a plântulas, com forte dominância apical. Quando colocados na presença de citocininas de uma forma geral, brotos axilares se desenvolvem prematuramente produzindo ramificações (brotos secundários e terciários) que originam uma proliferação em massa resultando numa grande produção de plantas com alta identidade genética.

Multiplicação por meio de cultura de calos: apesar da cultura de calo possibilitar a ocorrência de aneuploidias e poliploidias, acarretando em perdas da identidade genética do material propagado, o propagador pode distinguir claramente regenerantes aberrantes na primeira etapa do processo de multiplicação, eliminando as plantas indesejáveis. Esta técnica possibilita a obtenção de uma grande quantidade de plantas a partir de um único explante, sendo uma dos procedimentos mais eficientes na produção rápida de plantas in vitro. No entanto a propagação via calos deve ser evitada, principalmente, no caso de culturas economicamente importantes.

 

2- RECUPERAÇÃO DE PLANTAS ISENTAS DE VÍRUS (LIMPEZA CLONAL)

            Utiliza-se principalmente ápices caulinares para propagação de plantas isentas de vírus. Uma das vantagens deste sistema é a manutenção da identidade do genótipo (planta) regenerado, que ocorre na maioria dos casos em virtude das células do meristema do ápice caulinar serem mais estáveis geneticamente. Além disso, o ápice é uma estrutura organizada, que pode desenvolver-se diretamente em parte aérea, em meio de cultura adequado, sem passar pela fase de calo (crescimento desordenada de células), o que poderia levar à alterações genéticas.

3- MICROENXERTIA

            Essa técnica consiste em microenxertar, em condições assépticas, um ápice caulinar, contendo dois a três primórdios foliares, excisado de uma planta matriz, sobre um porta-enxerto estabelecido (cultivado) in vitro. Decapita-se o porta-enxerto e faz-se uma excisão em T invertido no seu topo, onde é introduzido o microenxerto. Com esta técnica torna-se possível a produção de matrizes de fruteiras e outras plantas arbóreas, com alta qualidade fitossanitária e com características adultas, não se revertendo ao estado juvenil.

 

4- CONSERVAÇÃO IN VITRO DE RECURSOS GENÉTICOS DE PLANTAS – CONSERVAÇÃO DE GERMOPLASMA.

A conservação de recursos genéticos vegetais é de grande importância , não só para a preservação de espécies, mas também para o melhoramento vegetal. A conservação in vitro é feita utilizando-se estratégias técnicas que possibilitam a preservação da identidade genética e o retardamento do crescimento das culturas, tais como: redução da temperatura de incubação, aplicação de retardantes osmóticos e hormonais no meio nutritivo, submersão  das culturas em óleo minerais, utilização de suspensões celulares em meios líquidos sob agitação, armazenamento do material em baixas temperaturas (- 196oC) ou criopreservação.

 

5- SUSPENSÃO CELULAR

Este processo é utilizado para a obtenção e proliferação de células em meio líquido, sob condição de agitação contínua, para evitar possíveis gradientes nutricionais e gasosos no meio de cultura. Além de ser uma técnica eficiente de multiplicação rápida, as suspensões celulares tem uma grande aplicação para o estudos de bioquímica, genética, citologia, fisiologia vegetal e fitopatologia. Este tipo de cultivo também é empregado na produção de metabólitos secundários ou material clonal em escala comercial pela utilização de biorreatores.

Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. O cultivo é realizado utilizando-se meio de cultura líquido, permitindo a renovação do ar durante este processo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc.

 

6- POLINIZAÇÃO E FERTILIZAÇÃO IN VITRO

A possibilidade de se obter novas combinações no cruzamento de plantas, resultando em híbridos inter e entra-específicos, intergenéricos ou entre espécies de famílias distintas, é dificultada por barreiras que podem ocorrer antes da fertilização. Esta técnica permite, além de estudar os processos de polinização, transpor barreiras à fertilização, impostas pelo estigma, estilete ou ovário e recuperar híbridos interespecíficos e intergenéricos que não podem ser obtidos pelos métodos convencionais in vivo.

 

 

7- CULTURA DE EMBRIÕES

Este tipo de cultivo tem sido usado para superar dormência de sementes, em virtude da imaturidade do embrião ou da presença de substâncias inibidoras no endosperma; estudar os aspectos nutricionais e fisiológicos do desenvolvimento do embrião; testar a viabilidade de sementes; recuperar híbridos raros de cruzamentos incompatíveis; e como fonte de explantes devido a elevada totipotência.

 

8- CULTURAS DE OVÁRIOS

A cultura de ovários fornece um sistema controlado para o estudo dos aspectos nutricionais e fisiológicos do desenvolvimento de frutos e formação de sementes. Este método também é utilizado para a propagação de plantas, a indução de haplóides partenogênicos e a recuperação de híbridos interespecíficos e intergenéricos.

 

9- CULTURA DE PROTOPLASTOS

O cultivo de protoplastos (células vegetais desprovidas de parede celular) vem sendo utilizados no melhoramento de espécies de interesse agronômico, para obtenção de plantas transgênicas, de híbridos somáticos e de mutantes ou variantes somaclonais. Os protoplastos também constituem um sistema vegetal para o estudo da expressão de genes isolados e sua regulação.

 

10- OBTENÇÃO DE MUTANTES IN VITRO.

Por meio da utilização de agentes mutagênicos físicos (luz UV, raios X, raios gama etc) e químicos (antibióticos, alquilantes, azidas etc), é possível obter mutantes induzidos apresentando mutações gênicas, cromossômicas e extranucleares. Esta técnica tem uma grande aplicação para os melhoristas por possibilitar a ampliação da variabilidade genética.

 

11- EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA

Embriogênese somática, adventícia ou assexual são termos usualmente empregados para designar o processo pelo qual células haplóides ou somáticas desenvolvem-se por meio de diferentes estádios embriogênicos, dando origem a uma planta, sem que ocorra a fusão de gametas. A embriogênese somática é um método importante para propagação de plantas elite in vitro, em larga escala. Além de servir de modelo para estudos básicos relacionados com a fisiologia do desenvolvimento do embrião, esse sistema vem sendo utilizado para produção de plantas transgênicas e sementes sintéticas.

 

12- PRODUÇÃO DE HAPLÓIDES E DUPLOS HAPLÓIDES

Para a produção de haplóides são utilizados principalmente a cultura de anteras ou pólen, obtendo uma planta haplóide a qual passa por um tratamento específico com antimitóticos (ex.: colchicina) para a duplicação do cromossomos. Já os duplo-haplóides podem ser obtidos a partir da cultura in vitro de ovários ou óvulos não polinizados, ou após cultura de embriões resultantes de cruzamentos interespecíficos ou intergenéricos.

 

CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS X PLANTAS TRANSGÊNICAS

A aplicação dos princípios genéticos na obtenção de plantas com desempenho agrícola superior tem sido sistemático e determinante para o aumento da produtividade e para a conquista de novas fronteiras agrícolas. Para isto o emprego de vários métodos de melhoramento e a utilização de novas tecnologias, como a cultura in vitro de células e tecidos de plantas, têm sido determinantes. Estas técnicas são empregadas de diferentes formas no desenvolvimento de cultivares superiores de plantas. Em geral, são utilizadas em uma ou outra etapa do melhoramento, não necessariamente, no desenvolvimento direto de novas cultivares.

Com o advento dos transgênicos, que do ponto de vista de um melhorista, não passa de uma técnica avançada de melhoramento de última geração, a cultura de tecidos vegetais também vem contribuindo para o sucesso da transformação genética, dando suporte para a produção de transgênicos, sendo imprescindível no início (fornecendo células, protoplastos ou tecidos) e no fim do processo, regenerando e selecionando plantas geneticamente transformadas. Vale ressaltar que o primeiro grupo de cultivares transgênicos comercializado em diversas partes do mundo, como as resistentes a herbicidas, insetos e patógenos, foi desenvolvido mediante uso de cultura de tecidos em combinação com métodos de Biologia Molecular.

 

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